Desmond Miles, un barman secuestrado por los templarios en el año 2012, consigue huir de la prisión de Abstergo gracias a Lucy Stillman, una asesina actual. Tras un par de peleas a golpe limpio con los guardias de Abstergo, escapan en un coche hacia al refugio de asesinos actuales. Allí, como en Abstergo, los asesinos poseen un Animus, una máquina que permite conocer la vida de tus antepasados volviendo a su época. Esta vez, Desmond se transporta al Renacimiento, donde conoce a su antepasado, Ezio Auditore Da Firenze.Ezio Auditore Da Firenze, un joven italiano que vivía la "dolce vita" a sus 17 años, se encuentra en un momento trágico de su vida, cuando las familias "amigas" de los Auditore conspiran contra su familia y consiguen encarcelarlos. Ezio logra hablar con su padre, Giovanni Auditore, banquero de la ciudad y asesino en secreto, en la cárcel, donde éste le dice a su hijo que vaya a su casa, descubra una habitación contigua y secreta y se apropie de todo lo que encuentre allí. Ezio descubre en la habitación un baúl de su padre una vestimenta de asesino, una espada y una hoja oculta del credo asesino rota, que más tarde Leonardo Da Vinci reparará. No consigue impedir que asesinen a su padre y a sus dos hermanos, Federico y Petruccio. Ezio huirá de Florencia con lo que le queda de su familia, su hermana y su madre. Es asaltado por un grupo de soldados dirigidos por Vieri de Pazzi, enemigo principal de Ezio, en medio de campo abierto, y rescatado al borde de la derrota por su tío Mario, que lo lleva a su pequeña villa, Monteriggioni, donde aprende lo básico en lo referente a manejarse con la espada, así como técnicas de evasión y defensa, mientras aprende simultáneamente los secretos de su familia.Ezio Auditore logrará crecer como hombre a la vez que mejora sus dotes de asesino, fundamentales para llevar a buen puerto los desafíos que le esperan en la Italia Renacentista. Para ello, contará con la ayuda de personajes históricos tan influyentes como Leonardo Da Vinci, cuya visionaria concepción del arte, la naturaleza y la tecnología le llevarán a diseñar todo tipo de instrumentos con la única intención de ayudar a su querido amigo Ezio. El nuevo destino de este asesino se dibuja en la lejanía. Más allá de la venganza, se revela la necesidad de perpetrar el trabajo que, durante años, había llevado a cabo su progenitor entre las sombras. Una trama repleta de conspiraciones, engaños y enfrentamientos entre las familias más influyentes de la Italia Renacentista, sirven como telón de fondo para una propuesta interactiva cuyo argumento goza de un protagonismo mucho más acusado que el de la primera parte. Además, la acción se desarrolla desde el año 1476 hasta 1499, por lo que interpretaremos el rol de Ezio Auditore da Firenze en una de las épocas más importantes de su vida, algo que resulta muy enriquecedor para la compleja trama que compone el título. El desarrollo de la aventura está perfectamente estructurado, lo que hace muy interesante seguir desvelando misterios en aras de llegar hasta el emocionante desenlace de la historia en el cual el protagonista persige al "Español", el profeta de los caballeros templarios, Rodrigo Borgia, y este logra eludirlo pero pierde el fruto del Edén. Años después se convierte en Papa logrando así tener el poder de la llave que comparte poderes con el fruto. Ezio consigue vencer al poderoso templario, aunque, justo antes de asesinarlo, Borgia consigue zafarse y empuja a Ezio. Con ayuda del fruto del Edén en el cetro Papal, consigue abrir una cámara creada por los antiguos en la cual, donde según el templario debería estar Dios. Ezio acaba con él definitivamente antes de que entre en esa extraña cripta. Al penetrar él mismo se encuentra con la diosa Minerva, que habla sobre algo incomprensible para Ezio, pues es un mensaje a Desmond a través de los recuerdos del asesino donde le dice que la tierra perderá su campo magnético y será destruida por el Sol. Una vez acabado el mensaje de la diosa, se acaba la secuencia del Animus y es justo en ese momento cuando los templarios consiguen averiguar la localización exacta de aquel refugio. Llegan soldados y Warren Vidic, donde tienen una amarga conversación sobre lo que cometió al huir de abstergo, mientras Desmond pelea fieramente con una hoja oculta que Lucy le proporciona antes de marcharse. Durante pleno combate, el escondite empieza a derrumbarse y los cuatro asesinos del refugio consiguen huir, al igual que los Warren Vidic y los templarios restantes. La historia concluye con los asesinos huyendo y Desmond tumbado en una camioneta, volviendo a sus recuerdos en el animus.