Shinji se culpa por la muerte de Kaworu frente a un devastado Tokyo-3. Mientras tanto, Gendo y Fuyutsuki se oponen al "Programa de Complementación Humana" que SEELE quiere poner en marcha, pero SEELE decide prescindir de ellos, y los aparta del proyecto.

Shinji visita a Asuka en el hospital, donde se encuentra, en depresión y desnutrición debido al ataque de Arael, y le pide que lo ayude. La chica no reacciona, a pesar de que Shinji la zarandea y le grita, al no obtener respuesta la zarandea un poco mas, de tal manera que termina por ponerla boca arriba y ella revela su pecho desnudo. Shinji, al ver esto, despiertan en el oscuros deseos que mas adelante influirán en la historia.

Misato hackea la computadora de NERV y se encuentra con que se ha descubierto que la humanidad ya no puede evolucionar más, y que la única forma de que el hombre sea perfecto es mediante el Tercer Impacto: para ello se creó el "Programa de Complementación Humana". También descubre que los seres humanos son descendientes de Lilith, y que son el décimo octavo ángel.

SEELE trata de introducir un virus informático en la terminal central de NERV, pero Gendo libera a Ritsuko y ésta, mediante el programa protector 666, logra aislar el sistema. SEELE decide entonces atacar de una manera más directa, haciendo que el gobierno japonés invada militarmente el Geofront diciendo que NERV pretende provocar el Tercer Impacto.

Una vez las tropas japonesas han penetrado en el complejo, Misato ordena que Asuka sea llevada dentro del EVA-02 y sea lanzada a la superficie, quedando ésta bajo el lago del Geofront.

Misato consigue encontrar a Shinji, llegando justo a tiempo para evitar que tres soldados lo maten. Pretende llevarlo al hangar del EVA-01, pero como el chico se niega, lo obliga a ello.

Mientras tanto, Asuka, ya en el EVA-02, sostiene una lucha interior, de la que saca la conclusión de que no desea morir. Una vez despierta del coma, comienza a pelear contra las fuerzas japonesas, las cuales sólo poseen armas convencionales, por lo que las derrota fácilmente. Al ver SEELE que no podrían destruir así al EVA-02, deciden cortar el cable de energía del EVA-02, dejándola con sólo cinco minutos de autonomía, y envían a los EVAS del 05 a 13 (también llamados EVAS EN SERIE), que a diferencia de los EVAS del Geofront, no necesitan ni fuente externa de energía, ni piloto humano ...

El argumento está basado en los episodios del 1 al 6 de la serie original. Aunque algunas situaciones se muestran de diferente forma, tales como ángulos de cámara, historias alternativas, etc. 

Shinji Ikari llega a Tokyo-3, buscado por su padre Gendo. A su llegada, se encuentra con ejército de la ONU tratando de detener al cuarto Angel (el tercero en la versión original), Sachiel. Rescatado por Misato Katsuragi, Shinji llega a los cuarteles generales de NERV junto con su padre Gendo (que es el Supremo Comandante de NERV) con la casi amenaza de que si no pilotaba el EVA-01 (EVA 初号機, EVA shogōki?) y luchaba contra Sachiel, la misteriosa Rei Ayanami, que se encontraba en malas condiciones, sería enviada a pelear; por lo que acepta. Después de la primera batalla, en la que salió victorioso, Misato lo lleva a su casa para que viva con ella, vaya a la escuela y trate de tener una vida normal. 

Tras todo esto aparece un nuevo ángel: Ramiel, que comienza a taladrar el Geofront. Para motivar a un abatido Shinji, Misato lo lleva hasta el nivel más bajo de la base y le muestra al ángel Lilith. Misato explica que ese ángel es el objetivo de los Ángeles y que cualquier contacto entre ellos y Lilith traería el fin de toda la vida en la Tierra. 

Con esta información y el apoyo de sus nuevos amigos de la escuela, Shinji y Rei, con sus respectivos EVAs (01 y 00) intentan destruir a Ramiel usando un fusil de francotirador de positrones. Tras fallar el disparo, el ángel reacciona y dispara otro rayo que Rei bloquea con un escudo y con su propio EVA cuando éste cae, casi muriendo en el transcurso del combate y dando tiempo a Shinji a disparar exitosamente una segunda vez. Después, Shinji, temiendo por la vida de Rei, abre su Entry Pug con el Cuchillo Progresivo de la 01. En ese emotivo momento Shinji y Rei, normalmente fría, comparten una cálida sonrisa. 

La última escena ocurre en la superficie de la Luna, en lo que parece ser una gran franja salpicada de sangre de la misma. Nueve contenedores similares a ataúdes dispuestos en una línea en la superficie se muestran, con cinco de ellos abiertas. Kaworu Nagisa despierta y se levanta en del quinto contenedor. Delante de él hay un gigante blanco no identificado, rodeado de andamios y equipos de construcción, y llevando una máscara púrpura de Seele (Hay altas provabilidades de que este ser sea el segundo angel, Lilith). Kaworu se involucra en una breve conversación con un críptico monolito de SEELE, diciendo que desea conocer a Shinji.

La película comienza con el prólogo que abre con una nueva piloto, Mari Illustrious Makinami, que toma el control de la unidad Provisional 05 y trata de detener al Tercer Ángel, que está escapando de la Base de Betania de NERV, situada en el Ártico. El Ángel, después de haber sido encontrado en elpermafrost, fue capturado y confinado en el sistema de contención de Cocito (uno de los más seguros del mundo, según se comenta en la película), pero logró escapar, y cuando se dirige a los alrededores de la zona Aqueron, circundante a la base, el EVA 05 lo ataca. Después de recibir muchos daños, se ve destruida la unidad y acabado el Ángel, siendo eyectada en el Entry Plug y destruida gran parte de la base de Betania.

De vuelta en Japón, Shinji y Gendo visitan la tumba de Yui. Luego, Kaji llega al despacho de Gendo confirmando la interrupción del proyecto Marduk que se realizaba en Betania y le entrega una maleta que contiene la "Llave de Nabucodonosor", la llave para abrir la puerta de la Complementación Humana (tal vez el embrión de Adán). Entonces el Séptimo Ángel ataca la ciudad, pero es derrotado por la recién llegada Unidad 02 desde Alemania, pilotada por la fiera pelirroja Shikinami Asuka Langley.

Mientas tanto, Gendo y Fuyutsuki visitan la Base de Tabgha en la luna para ver el progreso de SEELE en la construcción de la Unidad 06 o Mark 06, y si bien el acceso a la base no les es permitido, verifican que el método de construcción de la Unidad es diferente al de NERV. Kaworu Nagisa, en el dedo del EVA, saluda a Gendo. Ya en la Tierra, Shinji se ve obligado a aprender a convivir con Asuka, que se muda a casa de Misato, y a su vez Asuka demuestra tener duras relaciones con todo el mundo, y algunos signos de amor/odio (de forma similar a la serie) con Shinji. Un día Kaji les lleva a un acuario, donde residen las últimas criaturas marinas con vida. Luego, se demuestra que Rei es vegetariana, cuando se niega a comer carne, pero descubre que la comida sin carne cocinada por Shinji le resulta deliciosa. El Octavo Ángel Sahaquiel ataca desde el espacio. Los satélites lanzan minas N2 pero no surte efecto debido al fuerte campo AT del Ángel, por lo que, después de un largo combate, las unidades 00, 01 y 02 lo destruyen, actuando en equipo como nunca antes lo habían hecho.

Al día siguiente, es el turno de Shinji para cocinar el almuerzo para la gente de su casa, y hace también para Rei, dándosela en la escuela, lo que irrita a Asuka. Este gesto abre las emociones de ella, que le pide a Gendo en la cena si podría invitar a sus amigos la siguiente semana (la cual nunca llega a realizarse). Más adelante, Mari aterriza en paracaídas en Tokyo-3, pero cae accidentalmente sobre un atónito Shinji mientras estaba en la terraza de la escuela. Después ella reconoce su identidad como piloto de EVA por el olor a líquido LCL.

Poco después es destruida en EE.UU la primera rama de NERV por la explosión del EVA 04 debido a la experimentación de nueva tecnología. NERV clausura la Unidad 02 por el Tratado del Vaticano, que limita el número de EVAs en servicio que un país puede tener; debido a que la jurisdicción de la Unidad 02 todavía estaba en manos de la Unión Europea, es Asuka la que pilota la Unidad 03. Sin embargo, el día de la activación de la unidad se descubre que estaba poseída por el Ángel Bardiel, que escapa en el EVA, todavía con Asuka en su interior. El EVA 01 es enviado a detenerlo, pero Bardiel despliega dos brazos que estrangulan a Shinji, que se niega a pelear para no herir a Asuka. Ante ello, Gendo activa el Dummy Plug y destroza al EVA 03, triturando con los dientes de la 01 el Entry Plug, aparentemente muriendo Asuka. Shinji enloquece ante ello y ataca el Geo-front, pero es detenido por el aumento de la presión del LCL en su cápsula. Al despertar, decide dejar NERV. Luego se anuncia que Asuka está viva, pero gravemente herida e infectada en parte por el Ángel.

Tras marchar Shinji, Zeruel el Décimo Ángel, traspasando la línea de defensa de Old Odawara ataca destruyendo las 24 capas protectoras del Geo-front. Mientras, Mari es enviada a pelear con el Ángel secuestrando la Unidad 02 del almacén. Mari, al ver que no surten efecto sus ataques, quita los limitadores y activa el Modo Bestia (BEAST MODE) de la 02, un modo artificial de inducir al EVA al modo berserker, pero aun así resulta derrotada. Rei, a bordo de la Unidad 00, ataca al Ángel con un misil N2, tratando de insertarlo en el núcleo del Ángel, pero fracasa por la alta resistencia del campo AT, que le frena en su intento de penetrarlo. Entonces Mari rompe el campo AT del Ángel y Rei consigue detonar dentro de él la bomba, pero sin efecto, debido a una membrana blindada desplegada por al Ángel Zeruel sobre su núcleo. La Unidad 00 agota la energía y queda inmóvil, y la 02 cae sobre el lugar donde se hallaba Shinji. Mari le dice a Shinji que escape, y él, al ver que el Ángel devoró y asimiló a la Unidad 00 y a Rei, decide regresar a NERV. Furioso, le pide a Gendo que lo deje pilotar. Momentos después el Ángel destruye la última defensa y penetra el Dogma central, pero es atacado por la Unidad 01. Ésta se queda sin energía y Shinji activa el modo transicicion (hacia el modo GOD) inconscientemente consiguiendo de alguna forma un poder similar al de un Ángel.

Con sus nuevos poderes derrota a Zeruel, y forzando sus límites intenta rescatar a Rei. Accediendo a su núcleo, eventualmente la encuentra desnuda y agazapada en la oscuridad. Ella le dice que está conectada espiritualmente con el Ángel, con lo que decide morir para destruirlo, pero Shinji la detiene, prometiendo rescatarla. Shinji se sincroniza completamente con la Unidad 01 y saca a Rei y el núcleo del Ángel, que adoptan la forma de Rei en gran escala; entonces Ritsuko anuncia que ha llegado el Tercer Impacto, la creación de una nueva forma de vida más allá de la comprensión humana, siendo su precio cada una de las formas de vida antigua.

Después de los créditos de la película, una lanza cae del cielo y atraviesa al EVA 01/Ángel/Rei, interrumpiendo el Tercer Impacto. Kaworu, autor del lanzamiento de la lanza a bordo de la Unidad 06, desciende del cielo y anuncia: "El momento prometido ha llegado. Shinji, esta vez sólo tu hallarás la felicidad eterna...".